宝庆二年（1226）进士，授新喻主簿。历知余干县、处州、镇江、隆兴府、太平州、临安府、建康府、江陵府及户部尚书、浙西安抚使、江东安抚使、宝章阁学士、明殿学士、资政殿学士等。
从真德秀学，宝祐三年（1255）累官至户部尚书兼知临安府、浙西安抚使；继加宝章阁直学士、沿江制置使、江东安抚使，知建康府兼行宫留守兼节制和州、无为军、安庆府三郡屯田使。
至建康，即以常例公用器皿钱20万缗支犒军民；削减租税，养鳏寡孤疾之人；招兵置寨，给钱助诸军婚嫁；属县税折收丝绵绢帛，倚阁除免以数万计；兴学校，礼贤才，僚属皆极一时之选。。为方便行人，他搜集旧名或起新名并亲书坊巷名匾额33处。宝佑五年，建康大雪，他自己捐钱30万缗赈济军民。
继调荆湖制置，知江陵府，建康百姓怀念不已。理宗闻知，命以资政殿学士、沿江制置使、江东学抚使衔，于开庆元年（1259）再任建康知府。
马光祖益思宽养民力，兴废起坏。免除前政亏欠钱百余万缗，罢减渔利税课，赐益于民。又修建明道南轩书院及上元县学。撙节费用，建平籴仓，贮米15万石，又为库贮籴本200余万缗，发粜常减于市价，以利于民。修饬武备，防拓要害，为政宽猛适宜，事存大体，边赖以安。继进大学士兼淮西总领，召赴行在，升提领户部财用兼知临安府、浙西安抚使。
时值岁饥，荣王府积粮不发。马光祖一连三日往谒才得见，对之厉声说：“天下孰不知大王子为储君，大王不于此时收人心乎?”王以无粮辞，马光祖取怀中文书，一一陈说某庄某仓贮粮若干，王语塞，得粮活民甚多。
进同知枢密院事。差知福州、福建安抚使。后以沿江制置、江东安抚使再知建康府。三次任建康知府，累计12年，威惠并行，百废修举。建康郡民为其建生祠6所。
咸淳三年（1267）六月，拜参知政事，五年进枢密使兼参知政事，以金紫光禄大夫致仕。
卒后谥“庄敏”。《宋史》卷四一六有传。